Phổ MS — Bài Giảng & Công Cụ Trực Quan
Khối phổ (MS) là kỹ thuật phân tích đo tỉ lệ khối lượng trên điện tích (m/z) của các ion. Khác với IR hay NMR, nó không dùng bức xạ điện từ để thăm dò dao động liên kết; thay vào đó, nó tách vật lý các ion theo khối lượng. Kết quả là phổ khối: đồ thị cường độ tương đối (%) theo m/z, cho thấy các khối lượng ion nào có mặt và mức độ phong phú của chúng.
Một máy khối phổ có năm thành phần thiết yếu hoạt động tuần tự:
| Giai Đoạn | Thành Phần | Chức Năng |
|---|---|---|
| 1. Đưa Mẫu Vào | Đầu vào mẫu | Bay hơi mẫu trong chân không |
| 2. Ion Hóa | Nguồn ion | Chuyển đổi phân tử trung hòa thành ion (xem bên dưới) |
| 3. Phân Tách | Bộ phân tích khối | Tách ion theo m/z (từ trường, tứ cực, TOF, v.v.) |
| 4. Phát Hiện | Đầu dò | Đo độ phong phú ion tại mỗi m/z |
| 5. Đầu Ra | Hệ thống dữ liệu | Tạo ra phổ khối |
Toàn bộ hệ thống hoạt động trong chân không cao (~10⁻⁵ đến 10⁻⁷ torr) để ngăn ion va chạm với phân tử khí trước khi được phát hiện.
Lựa chọn phương pháp ion hóa phụ thuộc vào loại mẫu. Các phương pháp phổ biến nhất trong hóa học hữu cơ là:
| Phương Pháp | Viết Tắt | Nguyên Lý | Tốt Nhất Cho |
|---|---|---|---|
| Ion Hóa Điện Tử | EI | Chùm electron 70 eV bứt một electron: M → M⁺• + e⁻. Tạo phân mảnh nhiều. | Hợp chất hữu cơ nhỏ bay hơi; tra thư viện |
| Ion Hóa Hóa Học | CI | Khí thuốc thử (CH₄, NH₃) proton hóa chất phân tích: M + H⁺ → [M+H]⁺. Nhẹ nhàng hơn EI. | Phân tử kém bền; xác nhận khối lượng phân tử |
| Ion Hóa Phun Điện | ESI | Dung dịch phun qua kim điện áp cao; tạo ion tích điện nhiều lần. | Protein, peptide, polymer; LC-MS |
| Laser Hỗ Trợ Ma Trận | MALDI | Giải hấp laser từ tinh thể đồng phân ma trận; ion tích điện đơn. | Phân tử sinh học lớn, polymer |
Khối phổ có thể nói là kỹ thuật phân tích đơn lẻ giàu thông tin nhất. Nó cung cấp:
Chỉ cần lượng mẫu từ nanogram đến microgram, phù hợp cho phân tích vết, pháp y, giám sát môi trường và kiểm soát chất lượng dược phẩm.
| Đặc Điểm | Ký Hiệu | Định Nghĩa |
|---|---|---|
| Ion phân tử | M⁺ (hoặc M⁺•) | Phân tử nguyên vẹn mất một electron; cho khối lượng phân tử |
| Peak cơ sở | 100% | Ion phong phú nhất; các ion khác tính tương đối so với nó |
| Ion mảnh | m/z < M⁺ | Sản phẩm đứt liên kết — tiết lộ các yếu tố cấu trúc |
| Peak đồng vị | M+1, M+2 | Đóng góp đồng vị tự nhiên (¹³C, ³⁷Cl, ⁸¹Br, v.v.) |
| Ion giả bền | Rộng, thấp | Ion phân mảnh trong bộ phân tích; peak khuếch tán rộng |
Trong EI-MS, ion phân tử M⁺• được hình thành bằng cách loại bỏ một electron khỏi phân tử nguyên vẹn. Nó xuất hiện ở giá trị m/z cao nhất trong phổ (bỏ qua các peak đồng vị) và bằng khối lượng phân tử danh nghĩa (tổng khối lượng đồng vị phong phú nhất của tất cả nguyên tử).
1. Là peak khối lượng cao nhất (trừ các peak đồng vị M+1, M+2).
2. Phải là sự mất khối lượng hợp lý từ mảnh: hiệu M⁺ − mảnh phải tương ứng với một trung gian trung hòa bền (ví dụ •CH₃ = 15, H₂O = 18, CO = 28, HCl = 36/38).
3. Mất 3–14 và 21–25 Da từ M⁺ là không hợp lý về mặt hóa học — thường chỉ ra M⁺ bị nhận dạng sai.
4. Một số lớp hợp chất cho M⁺ yếu hoặc vắng (alkane phân nhánh, alcohol, amine). Dùng CI hoặc ESI để xác nhận MW trong những trường hợp này.
Một phương pháp kinh nghiệm hữu ích cho phổ EI của các hợp chất chỉ chứa C, H, O, N, S và halogen:
Ví dụ: Ethylamine (C₂H₇N, MW = 45) — M⁺ lẻ ✓ | Acetone (C₃H₆O, MW = 58) — M⁺ chẵn ✓
Mỗi nguyên tố có các đồng vị nặng xuất hiện tự nhiên. Điều này có nghĩa là mỗi ion phân tử đi kèm các peak đồng vị ở M+1, M+2, v.v. Cường độ tương đối của chúng tuân theo các mẫu có thể dự đoán và có tính chẩn đoán cho thành phần nguyên tố.
| Đồng Vị | Hàm Lượng Trong Tự Nhiên | Ảnh Hưởng Đến Phổ |
|---|---|---|
| ¹³C | 1,1% mỗi nguyên tử C | M+1 tăng theo số carbon: ~1,1 × n(C) % |
| ²H (D) | 0,015% | Đóng góp không đáng kể |
| ¹⁵N | 0,37% mỗi N | Đóng góp M+1 nhỏ |
| ¹⁷O / ¹⁸O | 0.04% / 0.20% | Đóng góp M+1 và M+2 nhỏ |
| ³³S / ³⁴S | 0,75% / 4,25% | Peak M+2 nhìn thấy (~4%) nếu có một S |
| ³⁷Cl | 24,5% (³⁵Cl 75,5%) | M+2 ≈ 1/3 × M⁺; mẫu đôi 3:1 đặc trưng |
| ⁸¹Br | 49,3% (⁷⁹Br 50,7%) | M+2 ≈ M⁺; mẫu đôi 1:1 đặc trưng |
Hiệu ứng đồng vị ấn tượng nhất về mặt trực quan xuất phát từ chlorine và bromine. Mẫu của chúng dễ nhận ra ngay lập tức:
| Mẫu chlorine | M : M+2 |
|---|---|
| 1 × Cl | 3 : 1 |
| 2 × Cl | 9 : 6 : 1 |
| 3 × Cl | 27 : 27 : 9 : 1 |
| Mẫu bromine | M : M+2 |
|---|---|
| 1 × Br | 1 : 1 |
| 2 × Br | 1 : 2 : 1 |
| 1 × Br + 1 × Cl | 3 : 4 : 1 : ··· |
Khối phổ độ phân giải thấp cho khối lượng danh nghĩa (số nguyên). Khối phổ độ phân giải cao (HRMS) đo m/z đến 4–5 chữ số thập phân, cho phép xác định công thức phân tử chính xác từ một phép đo duy nhất. Điều này khả thi vì khối lượng đồng vị chính xác của mỗi nguyên tố là duy nhất.
Ví dụ: C₂H₆O (ethanol, MW = 46) có khối lượng chính xác 46,0419, trong khi CH₂O₂ (axit formic, MW = 46) có khối lượng chính xác 46,0055. HRMS phân biệt chúng ngay lập tức; khối phổ độ phân giải đơn vị không thể.
Phân mảnh trong EI-MS tuân theo các quy tắc hóa học có thể dự đoán. Quan trọng nhất là:
| Hướng | Ký Hiệu | Mô tả | Mãnh vỡ |
|---|---|---|---|
| Cắt α | α | Liên kết cạnh dị nguyên tử hoặc C=O bị cắt đồng ly | Ketone mất •CH₃ (–15) hoặc •CₙH₂ₙ₊₁ |
| Cắt cảm ứng | i | Hướng theo điện tích; liên kết giữa vị trí điện tích và nhóm tách | Halide mất X• tạo [M−X]⁺ |
| Chuyển vị McLafferty | McL | Di chuyển γ-H qua trạng thái chuyển tiếp 6 nguyên tử; cần γ-H và C=O | Aldehyde, Ketone, este: sắp xếp lại electron chẵn |
| Retro-Diels-Alder | RDA | Hệ cyclohexen phân mảnh như phản ứng DA ngược | Terpen, steroid |
| Benzyl/tropylium | Ar | Cắt benzyl tạo tropylium bền (C₇H₇⁺, m/z 91) | Benzyl alcohol, ethylbenzene → m/z 91 |
MS là công cụ chính để xác định khối lượng phân tử và công thức của hợp chất chưa biết. Kết hợp với dữ liệu IR, NMR và UV-Vis, phổ khối cho phép xác định đầy đủ cấu trúc. Phương pháp hệ thống: xác định M⁺ → áp dụng quy tắc nitrogen → tính độ hụt hydrogen → phân tích mảnh chính → đề xuất cấu trúc → xác nhận với dữ liệu phổ khác.
GC-MS kết hợp sắc ký khí (tách hỗn hợp) với EI-MS (nhận dạng từng thành phần). Đây là kỹ thuật tiêu chuẩn vàng để nhận dạng hợp chất hữu cơ bay hơi trong hỗn hợp phức tạp. Mỗi peak tách được đối chiếu với cơ sở dữ liệu thư viện MS (NIST, SDBS) chứa hàng trăm nghìn phổ tham chiếu.
Sắc ký lỏng kết hợp hai khối phổ đặt kế tiếp nhau (LC-MS/MS) là kỹ thuật chủ đạo trong ngành dược phẩm. Nó nhận dạng và định lượng thuốc, chất chuyển hóa và dấu ấn sinh học trong dịch sinh học (huyết tương, nước tiểu, dịch não tủy) ở nồng độ pg/mL — vượt xa khả năng của các phương pháp khác.
Trong phát triển thuốc, LC-MS/MS được dùng cho nghiên cứu dược động học (theo dõi thuốc di chuyển qua cơ thể), nhận dạng chất chuyển hóa và phân tích tạp chất trong quá trình tổng hợp. Cơ quan quản lý yêu cầu dữ liệu MS cho hồ sơ phê duyệt thuốc.
Khối phổ ESI và MALDI đã cách mạng hóa sinh học bằng cách cho phép phân tích nhanh protein và peptide. Trong khảo sát protein "từ dưới lên", protein được tiêu hóa bằng trypsin và các peptide kết quả được nhận dạng qua mẫu phân mảnh MS/MS (ion b và y). Phần mềm tái tạo trình tự protein và xác định các sửa đổi sau dịch mã.
MS là kỹ thuật xác nhận trong hóa học pháp y. Kết quả dương tính của xét nghiệm miễn dịch phát hiện ma túy phải được xác nhận bằng GC-MS hoặc LC-MS/MS trước khi dùng làm bằng chứng pháp lý. MS cung cấp nhận dạng phân tử không mơ hồ vì sự kết hợp giữa thời gian lưu và phổ khối đầy đủ về cơ bản là duy nhất cho mỗi hợp chất.
Khối phổ tỉ số đồng vị (IRMS) đo lường tỉ lệ chính xác của các đồng vị bền (ví dụ: ¹³C/¹²C, ²H/¹H, ¹⁸O/¹⁶O) trong một mẫu thử. Vì tỉ số đồng vị thay đổi một cách có hệ thống theo địa lý, con đường sinh tổng hợp và điều kiện sinh trưởng. IRMS có khả năng xác định nguồn gốc địa lý của thực phẩm, xác thực các loại rượu vang lâu năm, phát hiện sử dụng chất kích thích trong thể thao (như doping testosterone), và kiểm chứng nguồn gốc thực vật của các sản phẩm tự nhiên.
Các kỹ thuật ion hóa môi trường mới (DESI, DART, REIMS) cho phép phân tích MS trực tiếp từ bề mặt, mô nguyên vẹn hoặc thậm chí sinh vật sống — không cần tách sắc ký hay chuẩn bị mẫu. Ứng dụng bao gồm đánh giá biên phẫu thuật theo thời gian thực trong mổ ung thư ("iKnife"), xác thực thực phẩm nhanh và sàng lọc dược phẩm giả mạo tại hiện trường.
|
Công Cụ Tương Tác
Công Cụ Trực Quan Phổ MS
|
|